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      1. 質譜技術

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        4D蛋白質組學服務

        4D蛋白質組學是在3D基礎之上增加了第四個維度--離子淌度(Ion?mobility)的分離,進而大幅度的提高掃描速度和檢測靈敏度,帶來蛋白質組學在鑒定深度、檢測周期、定量準確性等性能的全面提升。
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        蛋白質組學
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        產品描述

              傳統3D 質譜儀主要通過色譜保留時間(Retention time)、質荷比(m/z)、和離子信號強度(Intensity)這3 個維度對多肽- 離子進行定性和定量。在酸化的溶液中,蛋白質樣品會形成帶有多個帶正電荷(≥2+)的蛋白質離子。  然而蛋白質組樣品非常復雜,大量的雜質經過離子化之后,會形成帶1價電荷的離子,在質譜檢測過程中,干擾質譜儀對于多肽碎裂離子(一般為2/3/4 價)的檢測。因此,在3D 質譜條件下,蛋白質組很容易到達鑒定深度的瓶頸。

         
         

                 離子淌度概念的引入使得蛋白質組學進入了4D新時代。4D蛋白質組學是在3D基礎之上增加了第四個維度--離子淌度(Ion mobility)的分離,進而大幅度的提高掃描速度和檢測靈敏度,帶來蛋白質組學在鑒定深度、檢測周期、定量準確性等性能的全面提升。離子淌度,也叫離子遷移譜,即 ion mobility spectrometry(IMS),其核心原理是電場驅動下離子在氣體阻尼環境中的遷移速率差異,能夠根據離子的尺寸、形狀和電荷進行氣相分離,從而達到在離子進入MS前對雜離子進行預分離的效果,即為“離子清洗”。

         

                 離子淌度與質譜儀聯用后,一次分析就能夠同時提供多個維度信息,包括精確質量數(MS1)、二級碎片譜圖(MS/MS)和碰撞截面積(CCS)數據等,有效提升了對復雜生物樣品的定性和定量分析能力。

         

        根據工作原理的差異,離子淌度又分為幾個主要技術方案:

         

        1. 捕集離子淌度質譜 (Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS)

        2. 高場不對稱波形離子遷移譜 (Field asymmetric ionmobility spectrometry, FAIMS)

        3. 漂移時間離子遷移譜 (Drift-time ionmobility spectrometry, DTIMS)

        4. 吸入離子遷移譜(Aspiration ion mobility spectrometry, AIMS)

        5. 行波離子遷移譜(Travelling wave ion mobility spectrometry,TWIMS)  T-Wave®

         

        |   華盈生物4D蛋白質組學服務

              目前TIMS技術和FAIMS技術分別被Bruker和Thermo Fisher公司運用到蛋白質組學研究領域的質譜儀開發中,分別命名為Exploris 480+FAIMS pro和timsTOF Pro。華盈生物同時擁有該兩款主流的質譜儀,可根據實際應用場景為客戶提供匹配的4D質譜儀和對應的蛋白質組學檢測技術。

         

         

         

               經過大量項目測試發現:TimsTOF Pro具有上樣量少,掃描速度快的特點,對于微量樣品的檢測優勢尤為突出,特別適用于磷酸化等修飾組、穿刺樣本、流式分選細胞等微量樣品的蛋白質組學分析項目。480+FAIMS pro分辨率更高,可進行TMT 6/10/16標的標記定量蛋白質組檢測。同時,480+FAIMS pro鑒定深度也相對更高,特別適用于組織 / 器官蛋白組圖譜構建工作,是多組學聯合研究的推薦技術。

         

         

              因此,對于有深度蛋白質組研究需求的合作者,華盈生物將充分結合兩款質譜儀的特點以及專為4D質譜實驗研發的樣品前處理體系,為合作者提供合理的實驗方案。就華盈生物目前定量蛋白質組學的技術體系來說,Label Free、DIA、TMT、PRM和修飾蛋白組均可以進行升級,分別在兩款4D質譜儀上完成深度蛋白質組覆蓋檢測。

         

        |   項目經驗

              華盈生物已經完成了上百種類型樣品的定量蛋白質組學檢測。蛋白質組表達具有時空差異性,不同樣本的蛋白譜各有特點,下圖色塊大小代表的是華盈生物鑒定的不同樣本的蛋白譜數量差異。

         

        |   經典案例:timsTOF 4D質譜技術優勢

         

         

         

         

              該文獻是德國馬普生化研究所所長、世界著名蛋白質組學專家 Matthias Mann 教授于2018年發表于蛋白質組學領域頂級期刊 MCP的一篇關于4D質譜技術介紹的文章。該文章介紹了timsTOF Pro質譜系統,能實現更快速度、更高靈敏度、更強大的4D蛋白質組學分析,展現了其在蛋白質組學領域的強大功能和廣泛應用前景。

         

              作者結合一定的算法對肽段離子從m/z和離子淌度(ion mobility)兩個維度進行分析鑒定。從結果中我們可以看到,在m/z維度上不能分離的肽段離子,在離子淌度維度上能夠被清晰的分離(圖1,縱坐標)。

         

        圖1. 肽段離子的捕獲離子淌度分離

         

              此外,文章展示了timsTOF Pro的另一個技術,即平行累積連續碎裂PASEF(Parallel Accumulation Serial Fragmentation)(圖2)。該技術運用雙TIMS,實現離子在第一個TIMS中進行累積,然后在第二個TIMS中根據淌度進行分離,經過分離后的離子進入質譜系統。并且,當第二個TIMS進行分離時,第一個TIMS也同時在平行地累積離子,這樣可以實現近乎100%的離子利用率。

         

         

        圖2. timsTOF Pro上實現同步累積連續碎裂(PASEF)

         

              為了分析4D質譜對蛋白定量的準確性,研究者從皮爾森相關系數、中位數變異系數、缺失值定量準確度這四個統計角度進行了研究。在2h梯度、4次技術重復的條件下平均鑒定到5575個蛋白,結果顯示蛋白信號值的皮爾森相關系數為0.979,表明實驗的重復性非常好(圖3A)。MaxLFQ歸一化以后,中位數變異系數為7.2%(圖3B)。進一步,研究者發現4D質譜技術能夠顯著降低label-free缺失值的問題(圖3C)。同時,研究者將Hela和大腸桿菌胰酶消化后的肽段混合并進行質譜分析,結果顯示95%的蛋白是能準確定量,只有1.3%的蛋白被錯誤分類。展示了該方法高水平的定量準確性(圖3D)。

         

         

        圖3. labelfree蛋白組定量

         

              為了驗證4D蛋白組定量檢測速度和通量,研究者采用了100ng、50ng、10ng的Hela細胞樣品并在1h梯度和0.5h梯度條件下進行實驗。結果顯示,100ng、50ng、10ng的樣品量在1h的條件下分別可以鑒定到4513、4215、2723個蛋白(圖4A)。30分鐘內10ng的Hela細胞能夠鑒定到2100個蛋白(圖4B)。這個結果表明4D質譜非常適用于快速且高靈敏度的蛋白質組學應用。

         

         

        圖4. 4D質譜分析Hela蛋白組速度和靈敏度

         

              該文章詳細闡述了基于離子淌度的4D蛋白質組學,為蛋白質組學定量的準確性和靈敏度帶來了革命性提升,并且極大的減少檢測時間和樣品量。在提高掃描速度的同時,依然保持超高分辨率,這些獨特的性能,使其成為蛋白組學復雜樣本深入研究的利器。

         

        |   相關文獻

        [1]. Sun J, Han S, Ma L, et al. Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis. ACS Appl Mater Interfaces. 2021 Jan 27;13(3):3622-3630.

        [2]. Yu F, et al. Fast Quantitative Analysis of timsTOF PASEF Data with MSFragger and IonQuant. Mol Cell Proteomics. 2020 Sep;19(9):1575-1585.

        [3]. Bekker-Jensen DB, et al. A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Interface Improves Proteome Coverage in Short LC Gradients. Mol Cell Proteomics. 2020 Apr;19(4):716-729.

        [4]. Tian W, et al. Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease. Nat Commun. 2020 Nov 17;11(1):5859.

        [5]. Florian Meier et al. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 Dec;17(12):1229-1236.

        [6]. Meier F, et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics. 2018 Dec;17(12):2534-2545.

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