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        CAR-T生產工藝優化評估
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        CAR-T生產工藝優化評估

        CAR-T療法是高度個性化的,細胞治療產品的質量在批次和患者之間存在顯著差異。在開發過程中,最重大的挑戰之一是表征制備CAR-T產品的質量和效力。華盈生物利用IsoPlexis單細胞功能蛋白組學技術,可通過評價單個CAR-T細胞的多功能性,對CAR-T細胞質量進行評估....
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        產品描述

              CAR-T/CAR-NK療法正在改變腫瘤治療的前景,但其生產本身也面臨一系列挑戰。與大多數藥物不同,由于CAR-T療法使用患者自己的T細胞,是高度個性化的,細胞治療產品的質量在批次和患者之間存在顯著差異。在開發過程中,最重大的挑戰之一是表征制備CAR-T產品的質量和效力。華盈生物利用IsoPlexis單細胞功能蛋白組學技術,可通過評價單個CAR-T細胞的多功能性,根據其功能定義細胞的質量,有效幫助研究者很好的迎接CAR-T生產工藝的評估和改進的挑戰。

         
         
         

           

           

        |   精確的功能質量分析在CAR-T制備中的重要性

               在評價CAR-T產品評價過程中,細胞數量和活力的增加并不總是與細胞功能的增強跟最終治療效果正相關。而Isoplexis單細胞功能蛋白組分析獲得的細胞多功能指數 (Polyfunctional Strength Index PSI) 同時結合了數量和活力的維度。PSI同時涵蓋了細胞因子分泌的廣度(多功能,即分泌兩個或更多細胞因子的單個CAR-T細胞)和細胞因子分泌的強度(分泌量)。PSI可以作為獨特的標尺在治療應用之前評估細胞產品的效力。

        |   技術路線

            IsoPlexis系統可檢測每個單個細胞分泌的特定細胞因子,并識別多功能細胞和細胞亞群(分泌兩個或更多細胞因子),這些亞群在多種研究和疾病治療相關。IsoPlexis平臺還可以在表型相同的樣本中檢測到細胞功能異質性,而這些細胞及其異質性帶來的特質會被流式技術或群組檢測的技術忽略。IsoPLexis單細胞蛋白質組學分析系統可以對不同亞群的CAR-T細胞(CD4+/CD8+)進行功能的深度分析,多項研究數據顯示CAR-T細胞的多功能性指數(PSI)與患者臨床結果關聯,未來可成為細胞治療產品的療效預判與監控(圖1)。

        圖1 單細胞多功能性指數成為評估CAR-T細胞質量的重要指標

               研究人員使用Miltenyi自動化系統進行上游的靶向CD19/CD22雙特異性CAR-T制備,接著使用IsoPLexis單細胞蛋白質組學分析系統進行下游的細胞功能質量評估(圖2)。

        圖2  IsoLight單細胞蛋白質組分析系統成為CAR-T細胞生產工藝中的關鍵一環

               研究人員采用了兩種生產制備方法,對比了不同的方法制備的CAR-T細胞的差異。第一種方法(M1)在第5天以洗滌步驟終止轉染,而第二種方法(M2)在第3天終止轉染。復蘇的CAR-T細胞用抗CD4或抗CD8磁珠分選,并與表達CD19或CD22抗原的靶細胞共培養。去除靶細胞后,將CAR-T細胞懸液載入IsoCode單細胞蛋白質組芯片,捕獲單細胞的細胞因子信號,數據使用IsoSpeak軟件進行分析(圖 3)。

                      圖3  Isoplexis分析CAR-T細胞的基本流程

               結果表明,無論是靶向CD19還是CD22的CD4+或者CD8+的CAR-T細胞產品,使用M2方法制備得到的細胞,細胞多功能指數更高(圖4)。即使用M2制備的CAR-T產品表現出更高的多功能性,也表現在效應性因子和刺激性細胞因子的增加。這一單細胞多功能數據清楚地表明,與之前使用的M1相比,M2顯著改善了雙特異性CD19/CD22 CAR-T細胞產品的功能。

         圖4  單細胞多功能性用于評估不同制備方法得到的CAR-T細胞產品

         技術優勢

               考慮到細胞治療產品生成跟品質,細胞治療行業從細胞處理工作流程,細胞分離、細胞培養到最終細胞產物的配方都需要更多自動化的流程。IsoPlexis的IsoLight單細胞因子檢測系統采用全自動檢測的工作方式和端到端(End-to-end)工作流程,包含細胞培養,捕獲因子信號,多重因子檢測,影像數據讀取及導出。簡單直觀的IsoSpeak多維生信分析軟件,無需特別培訓生信分析人員來進行數據分析。大幅提高工程細胞產品開發和流程的優化。

        |   經典案例 (點擊可觀看視頻)

              早在2018年一篇Blood雜志文章中研究了治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)靶向CD19 CAR-T細胞,檢測了在輸注前CAR-T細胞的多功能性及PSI指數,并發現與臨床結果有正相關性。研究表明,這些患者輸注前CAR-T的多功能性與患者接受治療后的客觀反應(OR)和細胞因子釋放綜合征(CRS)具有統計學正相關性,通過單細胞體外實驗能夠預測臨床治療結果及不良反應。PSI可以有效區分對治療有應答者和無應答者(圖5)。

         圖5  CAR-T細胞PSI與患者預后具有顯著相關性

               2020年Gastroenterology雜志發表一項CAR-T改良方法靶向實體瘤的研究。研究對比分析了靶向肝細胞癌高表達 的GPC3兩個不同抗原表位的CAR-T功效。研究者首先體外實驗發現了靶向hYP7的CAR-T細胞比靶向HN3的CAR-T細胞具有更強的腫瘤殺傷能力。為了佐證這一結果,研究者采用了Isoplexis單細胞功能蛋白組分析兩種CAR-T細胞,結果發現了hYP7-CAR-T細胞具有更高的多功能性指數(PSI)。Isoplexis分析結果和體外效能相一致,為下一步的體內實驗提供了重要的質控評估依據。最終的體內實驗也證實了hYP7-CAR-T細胞具有更強的抑制和消除腫瘤細胞的能力(圖6)。

         圖6  單細胞功能蛋白組作為CAR-T細胞功效的質量評估指標

        |   相關文獻

        [1]. Spiegel JY, Patel S, Muffly L, Hossain NM, Oak J, Baird JH et al. CAR T cells with dual targeting of CD19 and CD22 in adult patients with recurrent or refractory B cell malignancies: a phase 1 trial. Nat Med. 2021;27(8):1419-1431.
        [2]. McKenna MK, Englisch A, Brenner B, Smith T, Hoyos V, Suzuki M et al. Mesenchymal stromal cell delivery of oncolytic immunotherapy improves CAR-T cell antitumor activity. Mol Ther. 2021;29(5):1808-1820.
        [3]. Fousek K, Watanabe J, Joseph SK, George A, An X, Byrd TT et al. CAR T-cells that target acute B-lineage leukemia irrespective of CD19 expression. Leukemia. 2021;35(1):75-89.
        [4]. Thomas A, Sumughan S, Dellacecca ER, Shivde RS, Lancki N, Mukhatayev Z et al. Benign tumors in TSC are amenable to treatment by GD3 CAR T cells in mice. JCI Insight. 2021;6(22):e152014.
        [5]. Roselli E, Boucher JC, Li G, Kotani H, Spitler K, Reid K et al.  4-1BB and optimized CD28 co-stimulation enhances function of human monospecific­and­bispecific­third generation­CAR­T­cells. J Immunother Cancer. 2021;9(10):e003354.
        [6]. Li D, Li N, Zhang YF, Fu H, Feng M, Schneider D et al. Persistent Polyfunctional Chimeric Antigen Receptor T Cells That Target Glypican 3 Eliminate Orthotopic Hepatocellular Carcinomas in Mice. Gastroenterology. 2020;158(8):2250-2265.e20.
        [7]. Schmidts A, Ormhøj M, Choi BD, Taylor AO, Bouffard AA, Scarfò I et al. Rational design of a trimeric APRIL-based CAR-binding domain enables efficient targeting of multiple myeloma. Blood Adv. 2019;3(21):3248-3260.
        [18. Rossi J, Paczkowski P, Shen YW, Morse K, Flynn B, Kaiser A et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 2018;132(8):804-814.

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